Fundația Ziehl-Neelsen Stain, Reactivi și tehnică

Ziehl-Neelsen pete într-o tehnică de colorare pentru identificarea microorganismelor rezistente la alcool și acid (AAR). Numele acestei proceduri de microbiologie se referă la autori: bacteriologul Franz Ziehl și patologul Friedrich Neelsen.

Această tehnică este un tip de colorare diferențială, care implică utilizarea de coloranți diferiți pentru a crea un contrast între structurile pe care doriți să le respectați, să le diferențiați și să le identificați ulterior. Pata Ziehl-Neelsen servește la identificarea anumitor tipuri de microorganisme.

Unele dintre aceste microorganisme sunt micobacterii (de exemplu,Mycobacterium tuberculosis), nocardias (de exemplu,Nocardia sp.) și unii paraziți unicelulari (de exemplu,Cryptosporidium parvum). Multe dintre bacterii pot fi clasificate printr-o tehnică comună denumită pete Gram.

Cu toate acestea, unele grupuri bacteriene necesită alte metode pentru a le identifica. Tehnicile, cum ar fi colorarea Ziehl-Neelsen, necesită combinații de coloranți cu căldură pentru fixarea primului la peretele celular.

Apoi vine un proces de decolorare care permite două rezultate: rezistență sau sensibilitate la decolorare prin acizi și alcooli.

index

• 1 Fundația
  • 1.1 Colorarea secundară
• 2 Reactivi
  • 2.1 Colorarea primară
  • 2.2 Soluție decolorantă
  • 2.3 Colorarea secundară (anti-colorant)
• 3 Tehnica
  • 3.1 Procedura de colorare acută-rapidă
• 4 Referințe

fundație

Baza acestei tehnici de colorare se bazează pe proprietățile peretelui celular ale acestor microorganisme. Peretele este format dintr-un tip de acizi grași numiți acizi mecolici; Acestea sunt caracterizate de lanțuri foarte lungi.

Când acizii grași au structuri foarte lungi, pot reține mai ușor coloranții. Unele genuri de bacterii sunt foarte greu de colorat prin pata Gram, datorită conținutului ridicat de acid mycolic al peretelui celular.

În pata Ziehl-Neelsen se folosește compusul fenolic carbol fuchsin, un colorant de bază. Acest lucru are capacitatea de a interacționa cu acizii grași din peretele celular, care este ceară în textură la temperatura camerei.

Pulberea cu carbol fuchsin este îmbunătățită în prezența căldurii, deoarece ceara se topește și moleculele de colorant se deplasează mai rapid în peretele celular.

Acidul folosit mai târziu servește la decolorarea celulelor care nu au fost colorate, deoarece peretele lor nu era suficient de înrudit cu colorantul; prin urmare, rezistența decolorizatorului acid este capabilă să îndepărteze colorantul acid. Celulele care rezistă acestei decolorări se numesc rezistent la acizi.

Culoarea secundară

După decolorarea probei, aceasta este în contrast cu o altă colorant numită vopsea secundară. Se utilizează, în general, albastru de metilen sau verde malachit.

Vopseaua secundară patăază materialul de fond și, prin urmare, creează contrast cu structurile care au fost vopsite în prima etapă. Numai celulele albite absorb cel de-al doilea colorant (anti-pete) și își iau culoarea, în timp ce celulele cu aciditate rețin culoarea roșie.

Această procedură este frecvent utilizată pentru identificarea Mycobacterium tuberculosis și Mycobacterium leprae, care se numesc bacili cu aciditate rapidă.

reactivii

Culoarea primară

Carboxin 0,3% fucsin (filtrat) este utilizat. Acest colorant este preparat dintr-un amestec de alcooli: fenol în etanol (90%) sau metanol (95%), iar în acest amestec se dizolvă 3 grame de fucsină de bază.

Soluție decolorantă

În această etapă, pot fi utilizate soluții de acid alcoolic 3% sau acid sulfuric 25%.

Colorare secundară (anti-colorant)

Colorantul cel mai frecvent utilizat pentru a efectua contrastul în eșantioane este de obicei 0,3% albastru de metilen. Cu toate acestea, puteți utiliza și alte persoane, cum ar fi 0,5% verde malachit.

tehnică

Procedură de colorare acidă rapidă

Pregătiți un frotiu bacterian

Acest preparat se face pe un diapozitiv curat și uscat, urmând precauțiile de sterilitate.

Uscarea frotiului

Lăsați frotiul să se usuce la temperatura camerei.

Se încălzește proba

Eșantionul trebuie să fie încălzit prin aplicarea focului pe diapozitivul de mai jos. O fixare cu alcool poate fi făcută atunci când frotiu nu a fost preparat cu spută (tratat cu hipoclorit de sodiu pentru ao albi) și dacă nu se va pata imediat.

M. tuberculosis Se elimină cu înălbitor și în timpul procesului de colorare. Setarea de căldură a sputei netratate nu va ucide M. tuberculosis, în timp ce fixarea cu alcool este bactericidă.

Acoperiți pata

Pata este acoperită cu soluția de carbol fuchsin (pata de bază primară).

Încălziți pata

Aceasta se face timp de 5 minute. Ar trebui să observați o eliberare a vaporilor (aproximativ 60 ° C). Este important să nu se supraîncălzească și să se evite arderea probei.

În ceea ce privește încălzirea petelor, trebuie să se acorde o mare atenție la încălzirea carbolului fuchsin, mai ales dacă colorarea este efectuată pe o tavă sau alt container în care au fost colectate substanțe chimice foarte inflamabile din colorația anterioară.

Doar o flacără mică trebuie aplicată sub diapozitive folosind un tampon luminat umezit cu câteva picături de alcool acid, metanol sau etanol 70%. Evitați utilizarea unui tampon mare înmuiat în etanol, deoarece acesta reprezintă un pericol de incendiu.

Spălați pata

Această spălare trebuie făcută cu apă curată. Dacă apa de la robinet nu este curată, spălați frotiul cu apă filtrată sau distilată, de preferință.

Acoperiti frotiul cu alcool acid

Acest alcool acid ar trebui să fie de 3%. Acoperirea se efectuează timp de 5 minute sau până când frotiu este suficient de decolorat, adică roz deschis.

Trebuie să se țină seama de faptul că alcoolul acid este inflamabil; prin urmare, ar trebui să fie utilizat foarte atent. Evitați apropierea surselor de aprindere.

Spălați pata

Spălarea trebuie să fie cu apă distilată curată.

Acoperiti frotiul cu vopsea

Poate fi malachit verde (0,5%) sau colorant albastru de metilen (0,3%) timp de 1 sau 2 minute, folosind cel mai lung timp dacă frotiu este subțire.

Spălați pata

Trebuie folosită din nou apă curată (distilată).

scurgere

Spatele culisei trebuie curățat și pata trebuie așezată pe un raft de drenare, astfel încât să fie uscată în aer (nu folosiți hârtie absorbantă pentru uscare).

Examinați frotiul sub microscop

Obiectivul 100X și uleiul de imersie trebuie utilizate. Scanați frotiul în mod sistematic și scrieți observațiile relevante.

Interpretați rezultatele

Teoretic, microorganismele care sunt vopsite într-o culoare roșiatică sunt considerate a fi pozitive rapid (AAR +).

Dimpotrivă, în cazul în care microorganismele sunt colorate în albastru sau verde, în funcție de colorantul utilizat ca colorant, acestea sunt considerate a fi un acid rezistent la alcool (AAR-).

referințe

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Essentials of Microbiology Practice (Prima ediție). Jaypee Brothers Medical Publishers.
2. Bauman, R. (2014). Microbiologie cu boli prin sistemul corpului (ed. 4). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Microbiologie introductivă (Prima ediție). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. și Morton, V. (2006). Manual de laborator și registru de lucru în domeniul microbiologiei: Aplicații pentru îngrijirea pacientului (Ediția a 11-a). McGraw-Hill Education.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Manual de Microbiologie (Prima ediție). B.l. Publicații PVT.